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Fluorescence imaging study to investigate the role of endosomal H₂O₂

엔도좀 과산화수소수 역할 조사를 위한 형광이미징 연구

Receptor-mediated endocytosis (RME) is a commonly recognized receptor internalization process of receptor degradation or recycling. However, recent studies have supported that RME is closely related to signal propagation and amplification from the plasma membrane to the cytosol. Few studies have elucidated the role of H2O2, a mild oxidant among reactive oxygen species (ROS) in RME and second messenger of signal propagation. In the present study, we investigated the regulatory function of H2O2 in early endosomes during signaling throughout receptor-mediated endocytosis. In mammalian cells with a physiological amount of H2O2 generated during epidermal growth factor (EGF) activation, fluorescence imaging showed that the levels of two activating phosphorylations on Ser473 and Thr308 of Akt were transiently increased in the plasma membrane, but the predominant p-Akt on Ser473 appeared in early endosomes. To examine the role of endosomal H2O2 molecules as signaling mediators of Akt activation in endosomes, we modulated endosomal H2O2 through the ectopic expression of an endosomal-targeting catalase (Cat-Endo). The forced removal of endosomal H2O2 inhibited the Akt phosphorylation on Ser473 but not on Thr308. The levels of mSIN and rictor, two components of mTORC2 that work as a kinase in Akt phosphorylation on Ser473, were also selectively diminished in the early endosomes of Cat-Endo-expressing cells. We also observed a decrease in the endosomal level of the adaptor protein containing the PH domain, the PTB domain, and the Leucine zipper motif 1 (APPL1) protein, which is an effector of Rab5 and key player in the assembly of signaling complexes regulating the Akt pathway in Cat-Endo-expressing cells compared with those in normal cells. Therefore, the H2O2-dependent recruitment of the APPL1 adaptor protein into endosomes was required for full Akt activation. We proposed that endosomal H2O2 is a promoter of Akt signaling.

수용체 매개 내포작용(RME)은 수용체의 분해 또는 재순환을 위한 널리 알려진 수용체 내재화 과정이다. 그러나 최근 연구에 따르면 RME는 세포막에서 세포질로의 신호 전달 및 증폭과 밀접한 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 활성산소종(ROS) 중 약한 산화제이자 신호 전달의 2차 메신저인 H₂O₂가 RME에서 수행하는 역할에 대해 규명한 연구는 거의 없다. 본 연구에서는 수용체 매개 내포 과정 전반에 걸친 신호 전달 중 초기 엔도좀 내 H₂O₂의 조절 기능을 조사하였다. 표피 성장 인자(EGF) 활성화 과정에서 생성되는 생리학적 양의 H2O2를 가진 포유류 세포에서, 형광 이미징을 통해 Akt의 Ser473 및 Thr308에 대한 두 가지 활성화 인산화 수준이 세포막에서 일시적으로 증가하는 것으로 나타났으나, 주된 p-Akt는 초기 엔도좀에서 Ser473에 나타났습니다. 엔도좀 내 H2O2 분자가 엔도좀에서 Akt 활성화의 신호 매개체로서 어떤 역할을 하는지 조사하기 위해, 우리는 엔도좀 표적 카탈라아제(Cat-Endo)의 이소성 발현을 통해 엔도좀 내 H2O2를 조절했다. 엔도좀 내 H₂O₂를 강제적으로 제거하자 Ser473 위치의 Akt 인산화는 억제되었으나, Thr308 위치의 인산화는 억제되지 않았다. Ser473 위치의 Akt 인산화에 키나아제 역할을 하는 mTORC2의 두 구성 요소인 mSIN과 rictor의 수준 또한 Cat-Endo 발현 세포의 초기 엔도좀에서 선택적으로 감소했다. 또한, 어댑터 단백질인 contai의 엔도좀 내 수준이 감소하는 것도 관찰되었다.