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In vitro transcribed(IVT) mRNA 치료제는 특정 핵산 서열을 전달하여 감염성 질병이나 암과 같은 다양한 질병을 예방하고 치료하는 유망한 전략을 제공합니다. 그러나 mRNA 서열과 poly(A) 꼬리 길이의 안정성과 동등성을 평가하는 것은 약물의 부작용을 최소화하고 효능을 보장하기 위해 필수적입니다. 하지만 poly(A) 꼬리와 같은 호모폴리머 연장 구간을 정확하게 측정하는 것은 기술적으로 어려우며, IVT mRNA에 특화된 방법이 부족합니다. 이를 해결하기 위해, 우리는 IVT mRNA의 poly(A) 꼬리 길이를 측정하는 데 최적화된 고정밀 시퀀싱 기술인 3AIM-seq을 소개합니다. 이 방법은 라이게이션 없이 어댑터를 연결한 후 3'말단 증폭을 통해 고품질의 시퀀싱 라이브러리를 준비하고, 슬라이딩 윈도우 방식을 사용하여 염기 품질 점수 기반으로 poly(A) 길이를 정밀하게 측정합니다. 인 실리코 합성 표준 스파이크인 실험으로부터 얻은 평균 절대 오차와 poly(A) 길이 간의 상관 관계를 이용하여 개별 DNA 분자 수준에서 poly(A) 길이의 균일성을 평가했습니다. 특히, 이 방법은 기존의 염기 해독 방법에 비해 더 정확한 길이 측정을 제공하였으며, 기존 방법은 상당한 부정확성을 보였습니다. IVT로 합성된 최대 70 염기까지의 poly(A) 구조는 정확히 측정되었지만, 100 염기를 초과하는 구조는 설계되지 않은 길이의 비율이 높아, 신중하고 철저한 평가의 필요성을 강조합니다. 따라서 3AIM-seq은 IVT mRNA 제품의 구조적 무결성을 평가하고, 임상 사용 전에 정량적 동등성을 보장할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.